Informatie over staalafname en aanvraag van laboratoriumonderzoek voor mutatieanalyse algemeen

Uitvoerfrequentie

Sequence Capture van DNA libraries (SeqCap): zie labogids.

KRAS, BRAF, NRAS wild-type blokkerende RQ-PCR of PCR gevolgd door Sanger sequencing: indien vereist (bevestiging NGS resultaat).

CTNNB1 mutatie-analyse en IDH1/IDH2 mutatie-analyse en POLE mutatie-analyse (PCR gevolgd door Sanger sequencing): indien vereist (bevestiging NGS resultaat).

POLE mutatie-analyse: 1x per week.

Antwoordtijd

De TAT voor een optimale klinische opvolging voor deze testen bedraagt 15 werkdagen (tijd tussen ontvangst van een geschikt staal op de dienst Pathologische Ontleedkunde en het rapporteren van het resultaat van de mutatie-analyse).

Staalsoort en minimale hoeveelheid

Steeds paraffine-ingebed weefsel (gebufferde formaldehyde 4%) of in gebufferde formaldehyde 4% gefixeerd weefsel met een zo groot mogelijke hoeveelheid tumor.

Een representatieve weefselblok (voorkeur) OF ongekleurde opgeplakte coupes zonder dekglaasjes (5 µm dikte), gesneden op een chemisch gereinigde microtoom om weefselcontaminatie te voorkomen:

  • indien blok gepreleveerd uit een chirurgisch specimen: 7 sequentieel genummerde blanco coupes
  • indien blok van endoscopisch biopsiemateriaal of punctiebiopsie van een metastase: 12 sequentieel genummerde blanco coupes

Afname instructies

  • Het meest courant gebruikte fixatief zoals gebufferde formaldehyde 4% is toegelaten. Het gebruik van andere fixativa of ongebufferde formaldehyde moet vermeld staan op het aanvraagformulier; in dit geval worden de resultaten niet gegarandeerd, en zal er contact opgenomen worden met de verwijzende arts over het verloop van de test.
  • Het laboratorium voert continue bijkomende validaties uit voor de verschillende fixativa.

Exclusiecriteria

  • Stalen met een tumorload <10%. Het percentage tumorcellen bepaalt mede de detectielimiet van de test. Weefsel waarin zones met een hoog percentage tumorweefsel aanwezig zijn, zorgen voor de meest betrouwbare resultaten.
  • Stalen waarin geen tumor aanwezig is. De aanvragende clinicus staat ervoor in dat een representatief staal aangeleverd wordt.
  • Weefsels gefixeerd in andere fixatieven dan formol (bvb. Carnoy, Bouin, B5, AFA, …). Het Laboratorium zal in dit geval contact opnemen met de aanvragende arts over het verloop van de test.
  • Gedecalcificeerd weefsel.

Aanvraagformulier of begeleidende brief (externe artsen)

  • Patiëntidentificatie
  • Specimen identificatie (nummer staal en paraffineblok)
  • Specimen type en lokalisatie
  • Type fixatief
  • Tijd tot fixatie (indien beschikbaar: minder dan 1 uur / meer dan 1 uur)
  • Fixatieduur (indien beschikbaar: minder dan 6 uren / tussen 6 en 48 uren / meer dan 48 uren)
  • Aanvragende arts

Verzending

Het staal kan opgestuurd worden op kamertemperatuur (formaldehyde gefixeerd weefsel of paraffine ingebed weefsel/coupes) naar volgend verzendadres:

Pathologische Ontleedkunde
Campus Gasthuisberg - CDG 5de verdieping
UZ Leuven
Herestraat 49 - 3000 Leuven
Tel 016/336527
Fax 016 336548

Methode

1. Sequence Capture van DNA libraries (SeqCap): zie labogids.

2. Wild-type blokkerende RQ-PCR (back-up methode ter bevestiging van varianten terug gevonden met NGS).

KRAS mutaties in codon 12/13/61, NRAS mutaties in codon 12,13/61 of BRAF mutaties in codon 600 worden gedetecteerd met een "in huis" ontwikkelde KRAS, NRAS en BRAF wild-type blokkerende RQ-PCR op de LightCycler (LC) 480 gevolgd door cyclesequencing.

Amplificatie van wild-type DNA wordt voorkomen doordat een Locked Nucleic Acid (LNA) oligonucleotide, dat sterk bindt aan wild-type allelen de binding van de forward primer aan de wild-type sequentie en dus bijgevolg ook amplificatie, onmogelijk maakt. Het gemuteerde allel wordt selectief geamplificeerd. De detectie van de DNA amplificatie gebeurt met SYBR green op het LightCycler 480 toestel. Er wordt een relatieve kwantificatie (2-ΔCp) toegepast om numeriek een negatief staal van een positief (vermoedelijk mutant) staal te onderscheiden.

Alle positieve stalen worden vervolgens gesequenced (in 1 richting) om de specifieke mutatie aanwezig in het tumor DNA te bepalen.

Vooropgesteld dat er voldoende DNA kopieën zijn:

- is detectie mogelijk van ongeveer 0,5% mutant DNA in een achtergrond van wildtype genomisch DNA voor KRAS codon 12/13, 5% mutant DNA in een achtergrond van wildtype genomisch DNA voor KRAS codon 61, 5% mutant DNA in een achtergrond van wildtype genomisch DNA voor NRAS codon 12/13, 1% mutant DNA in een achtergrond van wildtype genomisch DNA voor NRAS codon 61 en 1% mutant DNA in een achtergrond van wildtype genomisch DNA voor BRAF codon 600.

3. PCR + Sanger sequencing (back-up methode ter bevestiging van varianten in IDH1, IDH2, POLE en CTNNB1 terug gevonden met NGS).

Voor het opsporen van recurrente mutaties in de genen CTNNB1, IDH1, IDH2 en POLE wordt PCR gevolgd door Sanger sequencing uitgevoerd.

Methode

Spectrum CTNNB1: exon 3 (vanaf codon 5 t.e.m. 61) IDH1: exon 4 (vanaf codon 114 t.e.m. 135) IDH2: exon 4 (codon 128 t.e.m.178) POLE: exon 9 (codon 268 t.e.m. 303), exon 11 (codon 341 t.e.m. 369 ), exon 13 (codon 409 t.e.m. 453) en exon 14 (codon 454 t.e.m. 491)
Detectielimiet 10% mutante allelen (20% tumorcellen) 10% mutante allelen (20% tumorcellen) 10% mutante allelen (20% tumorcellen) 10% mutante allelen (20% tumorcellen)

Indicatie

1. Gemetastaseerde colorectale tumoren (mCRC)

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

Afwezigheid van mutaties in KRAS en NRAS genen (RAS wild-type) selecteert deze patiënten met een invasief CRC die kandidaat zijn voor anti-EGFR monoclonaal antilichaam therapie (bijvoorbeeld: cetuximab of panitumumab). Uit onderzoek is immers gebleken dat de aanwezigheid van activerende mutaties in codon 12, 13, 59, 61, 117 en 146 van de KRAS/NRAS genen bij patiënten met colorectale tumoren correleert met een slechte respons op de behandeling met deze EGFR inhibitoren (1, 2).

De KRAS/NRAS genen coderen voor een klein G proteïne dat downstream functioneert van de EGFR geïnduceerde signaalcascade. De KRAS/NRAS eiwitten worden geactiveerd als reactie op extracellulaire signalen zoals groeifactoren, cytokines en hormonen die binden aan EGFR/Her receptoren. De werking van KRAS/NRAS baseert zich op een verandering van de inactieve staat, waarbij de proteïnen gebonden zijn aan guanosine difosfaat (GDP) naar een actieve staat waarin de omzetting naar guanosine trifosfaat (GTP) zal voorkomen. In fysiologische condities wordt na een korte tijd het wild type KRAS/NRAS eiwit geïnactiveerd. Mutaties in het KRAS/NRAS gen resulteren echter in een eiwit met een verhoogde activiteit, onafhankelijk van stimulatie van upstream EGFR/Her receptoren (3).

KRAS mutaties worden teruggevonden in ongeveer 40% van de colorectale tumoren. De overgrote meerderheid van de mutaties komen voor in codon 12 (wild-type GGT) en codon 13 (wild-type GGC) van exon 2 (hotspot) van het KRAS gen. Een minderheid van de mutaties komt voor in codon 59, 61 (exon 3) en 117 en 146 (exon 4). NRAS mutaties worden terug gevonden in ongeveer 4% van de colorectale tumoren (2).

In +/- 10% van de colorectale tumoren worden BRAF mutaties teruggevonden. De BRAF p.V600E in metastatische colorectale tumoren is geassocieerd met een slechte prognose (4). Er wordt tevens voorzichtig gesuggereerd dat de aanwezigheid van een BRAF mutatie in deze tumoren correleert met een slechte respons op de behandeling met EGFR inhibitoren (5).

2. Longadenocarcinomen

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

In longadenocarcinomen worden de meeste EGFR mutaties gedetecteerd in exon 18-21 van het EGFR gen (6). Het opsporen van specifieke mutaties in het EGFR gen in niet kleincellige longkanker (NSCLC) is belangrijk voor het bepalen van de klinische respons op tyrosine kinase inhibitoren zoals Gefitinib en Erlotinib. Uit onderzoek is gebleken dat activerende mutaties correleren met een effectieve behandeling met deze inhibitoren (6,7).

KRAS codon 12-13 mutaties worden teruggevonden in ongeveer 30% van de longadenocarcinomen. Deze mutaties komen mutueel exclusief voor met EGFR exon 18-21 mutaties. De hotspot mutaties in het KRAS-gen worden in de literatuur in verband gebracht met resistentie aan EGFR TKI (8).

Het MET gen codeert voor de hepatocyt growth factor receptor (HGFR). MET exon 14 mutaties komen voor in ongeveer 3% van de longadenocarcinomen. Deze omvatten deleties (50%) en puntmutaties (50%) ter hoogte van exon 14 splice sites die leiden tot exon 14 skipping, met als gevolg een verhoogde stabiliteit en oncogene activiteit van HGFR. De SeqCap methodologie is in staat om alle beschreven exon 14 puntmutaties te detecteren, maar niet alle beschreven deleties. Samengevat kunnen 62% van de longtumoren met MET exon 14 skipping gedetecteerd worden met deze techniek (9).

3. Maligne melanomen

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

Een vroege opsporing van een melanoom is erg belangrijk voor een succesvolle behandeling. Ongeveer de helft van alle patiënten met een maligne melanoom heeft een BRAF V600-mutatie. Voor patiënten met een BRAF p.V600E gemuteerd melanoom werd reeds aangetoond dat deze baat hebben bij behandeling met BRAF inhibitoren zoals vemurafenib (10, 11). NRAS mutaties komen voor in 15-20% van patiënten met primaire melanomen en hun metastases. NRAS mutaties komen het meest frequent voor in codon 61 (80-90%; exon 3) en slechts sporadisch ook in codon 12 en 13 (exon 2) (12,13). De eerste data uit klinische studies tonen aan dat patiënten met een NRAS codon 61 gemuteerd melanoom baat hebben bij behandeling met MEK inhibitoren (14). Melanomen met een NRAS mutatie zijn geassocieerd met een agressiever klinisch verloop en een slechte prognose (15).

Mutaties in KIT komen vooral voor in acrale (14% KIT mutanten) en mucosale (18% KIT mutanten) melanomen en in melanomen van huid chronisch beschadigd door de zon. Melanomen met een mutatie in KIT kunnen in aanmerking komen voor een doelgerichte behandeling met tyrosine kinase inhibitoren bij melanomen die daar gevoelig voor zijn (16).

4. Schildkliercarcinoma

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

De BRAF p.V600E mutatie wordt terug gevonden in 26-44% van de schildkliertumoren meer bepaald in papillaire schildkliertumoren en papillair afgeleide anaplastische schildklierkanker. De mutatie zou de oncogene transformatie kunnen initiëren. Het opsporen van de p.V600E mutatie speelt een rol in de diagnose van schildkliertumoren alsook in de prognose en behandeling. Tumoren met de p.V600E mutatie tonen een verhoogde kans op herval en metastases (17).

De BRAF p.K601E mutatie is de tweede meest voorkomende BRAF mutatie in schildkliertumoren en komt voornamelijk voor in de folliculaire variant van papillaire schildkliertumoren (18).

5. GIST

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

Moleculair genetisch onderzoek naar de aanwezigheid van mutaties in het KIT of het PDGFRA gen geeft bijkomende aanwijzingen die kunnen helpen bij het bevestigen of uitsluiten van de diagnose van gastrointestinale stromale tumoren (GIST), bij het testen voor constitutionele mutaties om een mogelijks erfelijke familiale GIST te onderzoeken, bij het kiezen van een therapie en bij het onderscheiden van synchrone GIST versus een enkele primaire GIST met meerdere metastasen (19).

BRAF mutaties worden eveneens gerapporteerd in een laag percentage van wild-type en KIT/PDGFRA gemuteerde gastrointestinale stromale tumoren (GIST) en veroorzaken resistentie aan imatinib (20).

6. Medulloblastoma

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

Medulloblastoma met een gemuteerd CTNNB1 gen vertegenwoordigen een afzonderlijke moleculaire subgroep binnen de medulloblastoma met een gunstigere prognose (bovendien kan de-escalatie van de therapie binnen deze subgroep overwogen worden) (21)

7. Desmoïd tumor

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

De differentiaal diagnose van desmoïd tumor kan zeer moeilijk zijn. Er moet onderscheid gemaakt worden met goedaardige fibroblastische en myofibroblastische lesies en met laaggradige sarcomen. Sporadische desmoïd tumor is geassocieerd met mutaties in CTNNB1 (aanwezig in 84-88% van de desmoïd tumoren) (22).

8.Glioma, cholangiocarcinoma, chondrosarcoma

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

IDH1 en IDH2 mutatie analyse met behulp van PCR+Sanger sequencing (back-up methode)

Mutaties in IDH1 (hotspotmutatie in codon 132) en IDH2 (hotspotmutatie in codon 172) zijn recurrent bij patiënten met glioma/intrahepatische cholangiocarcinoma/chrondrosarcoma/... (23, 24, 25).

Deze hotspotmutaties zijn in glioma geassocieerd met een gunstige prognose in vergelijking met IDH1/IDH2 wildtype glioma (23,24).

9. Endometriumcarcinoom

Mutatie-analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

POLE mutatie analyse met behulp van PCR+Sanger sequencing (backup methode)

Het POLE gen codeert voor de katalytische sub-eenheid van het DNA polymerase epsilon. Dit enzyme is betrokken in herstel en replicatie van chromosomaal DNA. Hotspot mutaties in het exonuclease domein van POLE (exonen 9, 11, 13 en 14) worden verondersteld te leiden tot verminderde proofreading capaciteit van het enzyme en bijgevolg de opeenstapeling van mutaties (ultra gemuteerde tumoren). Mutaties in het exonuclease domein van DNA polymerase epsilon komen voor bij ongeveer 10% van de endometriumcarcinomen. Dergelijke tumoren, behorende tot de ultragemuteerde POLE subgroep, zijn geassocieerd met een gunstige prognose (26).

10. Invasief borstcarcinoom

Mutatie analyse met behulp van NGS met de SeqCap methodologie (zie labogids)

Referenties

  1. Sidduqui AD, Piperdi B. KRAS mutation in colon cancer: a marker of resistance to EGFR-I therapy. Ann Surg Oncol 2010: 17:1168-1176.
  2. Douillard JY et al. Panitumumab-FOLFOX4 Treatment and RAS Mutations in Colorectal Cancer. NEJM 2013:369 (11):1023-1034.
  3. Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.2007:7; 295-308.
  4. Kalady et al. BRAF mutations in Colorectal Cancer Are Associated With Distinct Clinical Characteristics and Worse Prognosis. Dis Colon Rectum 2012; 55:128-133.
  5. De Roock et al.Effects of KRAS, BRAF, NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 2010; 11: 753-762.
  6. Sharma et al. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer 2007; 7: 169-181.
  7. Gazdar AF. Activating and resistance mutations of EGFR in non-small-cell lung cancer: role in clinical response to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Oncogene 2009; 28: S24-S31.
  8. Pao et al. KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PLoS Med.2005; 2.
  9. Frampton et al. Activation of MET via Diverse Exon 14 Splicing Alterations Occurs in Multiple Tumor Types and Confers Clinical Sensitivity to MET Inhibitors. Cancer Discov. 2015.
  10. Long et al. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in metastatic melanoma. J Clin Oncol. 2011; 29:1239-1246.
  11. Sharma et al. Targeted Inhibition of Mutated BRAF for Treatment of Advanced Melanoma and Its Potential in Other Malignancies. Drugs 2012; 72: 2207-2222.
  12. Colombino M. et al. BRAF/NRAS Mutation Frequencies Among Primary Tumors and Metastases in Patients With Melanoma. J Clin Oncol; 30: 2522-2529.
  13. Ellerhorst JK et al. Clinical Correlates of NRAS and BRAF Mutations in Primary Human Melanoma. Clin Cancer Res; 17: 229-235.
  14. Ascierto PA et al. MEK162 for patients with advanced melanoma harbouring NRAS or Val600 BRAF mutations: a non-randomised,open-label phase 2 study. Lancet Oncol 2013; 14: 249-256.
  15. Devitt B et al. Clinical outcome and pathological features associated with NRAS mutation in cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Res 2001; 24:666-672.
  16. Woodman and Davies, 2010, Targeting KIT en melanoma: A paradigm of molecular medicine and targeted therapeutics. Biochemical Pharmacology, 80: 568-574.
  17. Caronia et al. Role of BRAF in Thyroid Oncogenesis. Clin Cancer Res 2011; 17: 7511-7517.
  18. Afkhami et al. Histopathologic and Clinical Characterization of Thyroid Tumors Carrying the BRAFK601E Mutation Thyroid. 2016; 26: 242-247
  19. Wong et al., 2012, The UK NEQAS for Molecular Genetics scheme for gastrointestinal stromal tumour: findings and recommendations following four rounds of circulation. Journal of Clinical Pathology; published online on June 9, 2012.
  20. Miranda et al. KRAS and BRAF mutations predict primary resistance to imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clin Cancer Res. 2012; 18:1769-1776.
  21. Fattet et al. Beta-catenin status in paediatric medulloblastomas: correlation of immunohistochemical expression with mutational status, genetic profiles, ad clinical characteristics. J Pathol 2009.
  22. Le Guellec et al. CTNNB1 mutation analysis is a useful tool for the diagnosis of desmoid tumors: a study of 260 desmoid tumors and 191 potential morphologic mimics.Modern Pathology 2012, 25: 1551-1558.
  23. Sanson et al. Isocitrate dehydrogenase 1 codon 132 mutation is an important prognostic biomarker in gliomas. (2009) J Clin Oncol; 27: 4150–4154.
  24. Siegal et al. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. J of Clin Neuroscience 2015; 22; 437-444.
  25. Clark et al. Molecular Pathways: Isocitrate Dehydrogenase Mutations in Cancer. Clin Cancer Res (2016); 22 (8); 1-7.
  26. Talhouk A et al. A clinically applicable molecular-based classification for endometrial cancers. British Journal of Cancer (2015) 113, 299-310.

Opmerkingen

Indien het aangeleverde materiaal niet voldoet wordt de aanvragende arts verwittigd.

(*) De testen worden uitgevoerd in samenwerking met centrum menselijke erfelijkheid en het activiteitencentrum moleculaire diagnostiek.

Indien dit een afgedrukt formulier is, controleer http://www.uzleuven.be/nl/pathologische-ontleedkunde/staalafnames voor recentste versie.
Huidige versie PO-AL025-WW055-M12.

Laatste aanpassing: 14 juli 2021